Differential expression of PD‑L1 and PD‑L2 is associated with the tumor microenvironment of TILs and M2 TAMs and tumor differentiation in non‑small cell lung cancer

authors

Sumitomo et al.

journal

Oncology Reports

year

2022

doi

10.3892/or.2022.8284

category

clinical-oncology

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업데이트

2026-07-31

요약

본 연구는 절제된 non-small cell lung cancer(NSCLC) 환자 175명을 대상으로 tumor microenvironment(TME) 구성 요소인 TILs와 M2 TAMs의 density가 PD-L1 및 PD-L2 expression에 미치는 영향을 분석하였다. TILs와 M2 TAMs의 density 증가는 tumor cells(TCs) 및 tumor-infiltrating immune cells(ICs)에서의 PD-L1과 PD-L2 expression 모두와 유의미하게 연관됨을 확인하였다. 특히 PD-L1은 poorly differentiated tumor에서, PD-L2는 well-differentiated tumor에서 높은 expression을 보이는 상반된 양상을 보였다. 이 결과는 PD-L1-negative NSCLC 환자에서 PD-L2 evaluation의 임상적 필요성을 제시하며, immune-checkpoint inhibitor(ICI) 치료 전략 수립에 다각적인 biomarker 접근이 필요함을 시사한다.

방법

Study design은 단일 기관(retrospective cohort analysis)이며, 2011년 11월부터 2014년 12월까지 Kitano Hospital에서 수술받은 resected NSCLC 환자 175명을 포함하였다. TME profiling은 CD3(IHC)로 TIL density를, CD163(IHC)로 M2 TAM density를 측정하였으며, PD-L1은 Ventana SP263 assay, PD-L2는 Ventana BenchMark GX system을 사용하여 TCs와 ICs의 membrane staining percentage(%)로 정량화하였다. Cut-off 값은 TIL density 524 cells/mm², M2 TAM density 380 cells/mm²로 설정되었다. Endpoint는 TIL/M2 TAM density와 PD-L1/PD-L2 expression 간의 correlation 및 clinicopathological features(differentiation, histology, TNM stage)와의 연관성 분석이었으며, statistical analysis에는 t-test, ANOVA with Bonferroni/Dunn post hoc test, Pearson's correlation coefficient, χ² test를 사용하였다.

주요 결과

TIL density는 평균 948.1±890.6 cells/mm², M2 TAM density는 평균 382.5±381.9 cells/mm²로 측정되었으며, 두 지표 간에는 약한 positive correlation(r=0.262; P=0.0004)이 관찰되었다. TIL-high(>524) 군은 104명(59.4%), M2 TAM-high(>380) 군은 67명으로 분류되었다. TIL 및 M2 TAM density는 TCs와 ICs에서의 PD-L1 expression과 모두 강하게 연관되었으며(P<0.0001), PD-L2 expression 또한 TCs(TIL: P=0.0494, M2 TAM: P=0.0452)와 ICs(TIL: P=0.0048, M2 TAM: P=0.0125)에서 유의미하게 연관되었다. 그러나 PD-L1-positive TCs percentage와 PD-L2-positive TCs percentage 간에는 correlation이 없었다(r=0.019; P=0.8049). Tumor differentiation 분석 결과, PD-L1 expression은 well-differentiated tumor보다 moderately/poorly differentiated tumor에서 높았으며(P=0.0002 for TCs, P<0.0001 for ICs), PD-L2 expression은 역으로 well-differentiated tumor에서 더 높게 나타났다(P=0.0260 for TCs, P=0.0326 for ICs). Histology에 따라 squamous cell carcinoma(Sq)이 adenocarcinoma(Ad)보다 TIL 및 M2 TAM density가 유의하게 높았다(P=0.0206, P=0.0036).

통계 분석

분석 설계 — 이 연구는 NSCLC 환자의 종양 미세환경(TME) 구성 요소인 TILs와 M2 TAMs의 밀도가 PD-L1 및 PD-L2 발현(종양 세포와 면역 세포 모두에서)과 어떻게 연관되어 있는지, 그리고 이러한 발현이 종양 분화도(tumor differentiation)와 어떤 관계가 있는지를 규명하기 위해 수행되었다. 연구 설계는 2011년 11월부터 2014년 12월까지 Kitano Hospital에서 수술을 받은 연속적인 175명의 NSCLC 환자 코호트(retrospective cohort)를 대상으로 한 단면 분석(cross-sectional analysis)이다. Primary endpoint는 명시되지 않았으나, 핵심 관심 지표는 PD-L1/PD-L2의 발현 비율(percentage of positive cells)이며, 이는 TILs(CD3+)와 M2 TAMs(CD163+)의 밀도와 종양 병리학적 특성(분화도, 조직학 유형 등)과의 상관관계를 통해 평가되었다.

무엇을 위해 어떤 분석을 썼는가 — 연속형 변수(예: TIL/M2 TAM density, PD-L1/PD-L2 발현 %) 간의 선형 연관성을 확인하기 위해 Pearson's correlation coefficient를 사용하였다. 두 군 간 평균 차이(예: TIL-high vs low 그룹의 PD-L1 발현률)를 비교하기 위해 t-test를 적용했으며, 세 개 이상의 군 간 비교(예: 분화도 Well/Moderate/Poor에 따른 밀도 차이)에는 ANOVA와 Bonferroni/Dunn post hoc test를 사용하였다. 범주형 변수(예: 흡연 여부, 조직학 유형)와 다른 변수 간의 연관성을 평가하기 위해 χ2 test를 수행하였다. 모든 통계 분석은 SPSS v23.0 for Windows (IBM Corp.)를 통해 이루어졌으며, 유의수준은 양측 검정(two-sided) 기준 P<0.05로 설정되었다.

방법론 평가 — 잘 된 점으로는, PD-L1과 PD-L2 발현을 종양 세포(TCs)와 면역 세포(ICs)로 구분하여 세밀하게 분석했다는 점, 그리고 두 명의 연구자가 맹검(blinded) 상태로 판독하여 일치하지 않는 경우 재평가함으로써 측정 오류를 최소화하려 했다는 점이 있다. 또한, effect size(예: r 값, 평균 ± 표준편차)와 P-value를 함께 보고하여 통계적 유의성뿐만 아니라 임상적/생물학적 관련성의 강도를 파악할 수 있게 했다. 그러나 의심스러운 점은 다음과 같다. 첫째, 다변량 분석(multivariable analysis)이 전혀 수행되지 않아, 관찰된 연관성이 다른 교란 변수(confounders, 예: 연령, 성별, 병기 등)에 의해 설명될 가능성을 배제하지 못했다. 둘째, TIL과 M2 TAM의 cut-off 값(524와 380)을 "가장 높은 유의성(highest significance)"을 보이는 지점으로 임의로 설정했다는 점은 데이터 탐색적 접근(data-driven cutoff)으로 해석될 수 있으며, 이는 과적합(overfitting) 위험이 있고 외부 검증 없이 일반화하기 어렵다. 셋째, 다수의 상관관계 검정을 수행했음에도 multiple testing 보정(예: Bonferroni correction for correlation tests)에 대한 명시적 언급이 부족하다(ANOVA post-hoc에서는 언급되었으나, Pearson correlation 전반에는 적용되지 않은 것으로 보인다). 넷째, 결측치 처리(missing data handling) 방법이 원문에 명시되지 않음.

설계에 참고할 점 — 유사한 연구를 설계할 때는, 단순 상관관계 분석을 넘어 다변량 회귀 모델(multivariable regression model)을 포함하여 주요 교란 변수를 보정해야 하며, cut-off 값 설정 시 ROC curve나 Youden index 등 객관적인 기준을 사용하거나, 연속형 변수로 유지하여 분석하는 것이 더 엄밀하다. 또한, 다중 검정에 대한 보정을 명시하고, 결측치 처리 방법을 투명하게 보고하며, 가능하면 외부 검증 코호트(external validation cohort)를 확보하여 결과의 일반화 가능성을 높이는 것이 필요하다.

강점

본 연구는 PD-L1과 PD-L2를 동시에 평가하여 NSCLC의 TME에서 두 biomarker의 상이한 발현 패턴을 명확히 구분하였다. 특히 TILs와 M2 TAMs이라는 구체적인 immune cell subsets을 정량화하여 PD-L ligand expression과의 인과적 연관성을 통계적으로 입증했다는 점이 강점이다. Ventana SP263 assay를 사용하여 TCs와 ICs 모두에서 표준화된 staining을 수행함으로써, 기존 연구들이 주로 TCs만 평가했던 한계를 극복하고 더 포괄적인 immune landscape를 제시하였다.

한계

본 연구는 단일 기관의 retrospective cohort로 구성되어 있어 selection bias가 존재할 수 있으며, 표본 크기(n=175)가 상대적으로 작아 subgroup 분석의 통계적 검정력이 제한적이다. 또한, PD-L2 antibody(ProteinTech)가 FDA 승인된 commercial assay가 아니므로, 다른 연구 결과와의 직접적인 비교나 임상 적용 시 재현성에 대한 검증이 추가로 필요하다. 생존 분석(survival analysis)이나 ICI 치료 반응률 등 clinical outcome과의 연관성이 포함되지 않아, biomarker의 prognostic 또는 predictive value를 직접적으로 입증하지는 못하였다.

해석

PD-L1과 PD-L2가 tumor differentiation에 따라 상반된 발현 패턴을 보인다는 점은, NSCLC의 병리학적 subtype에 따라 immune checkpoint blockade의 target selection이 달라질 수 있음을 시사한다. 특히 well-differentiated tumor에서 PD-L2가 우세하게 발현된다는 결과는, PD-L1-negative 환자군에서도 PD-L2를 타겟으로 한 치료 전략(예: anti-PD-1/PD-L2 combination)의 잠재적 유효성을 뒷받침한다. 이는 기존에 PD-L1 single-agent therapy로 반응하지 않던 환자들에게 새로운 biomarker 기반의 치료 옵션을 모색하는 데 중요한 근거가 될 수 있으며, 향후 다중 ligand blockade trial 설계 시 고려해야 할 핵심 변수이다.